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心血管疾病是全球人口死亡的首要原因[1]，我國(guó)更是全球心血管疾病負(fù)擔(dān)最重的國(guó)家之一，其導(dǎo)致的死亡占我國(guó)人口總死亡的40%以上[2]，其中動(dòng)脈粥樣硬化性心血管病（Atherosclerotic Cardiovascular Disease, ASCVD）占心血管疾病死亡的60%以上[3]。
動(dòng)脈粥樣硬化性疾病是指動(dòng)脈粥樣硬化病變引發(fā)的重要器官血液供應(yīng)障礙、進(jìn)而導(dǎo)致器官功能紊亂的疾病，主要包括冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化性腦血管病、肢體動(dòng)脈粥樣硬化、腎動(dòng)脈粥樣硬化、頸動(dòng)脈粥樣硬化和主動(dòng)脈瘤等。ASCVD是一種與脂質(zhì)代謝和炎癥息息相關(guān)的慢性進(jìn)展性血管疾病，其病變過程涉及多種血管細(xì)胞[4]與炎性免疫細(xì)胞[5]，包括內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等?；颊卟∏榈妮p重緩急與其病變部位高度相關(guān)。
動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病過程十分復(fù)雜，其確切病因尚未完全闡明，一般認(rèn)為系由多種遺傳和環(huán)境因素相互作用所致。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展機(jī)制涉及多種學(xué)說(shuō)，分別有脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)、血栓形成學(xué)說(shuō)、損傷應(yīng)答學(xué)說(shuō)、氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)、炎癥學(xué)說(shuō)、單克隆學(xué)說(shuō)、同型半胱氨酸學(xué)說(shuō)、精氨酸學(xué)說(shuō)、受體缺失學(xué)說(shuō)、免疫反應(yīng)學(xué)說(shuō)、干細(xì)胞學(xué)說(shuō)、表觀遺傳學(xué)說(shuō)及基因調(diào)控學(xué)說(shuō)和剪切應(yīng)力學(xué)說(shuō)[6]。
PART 01
ASCVD的主要發(fā)病機(jī)制-脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)
脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)是目前得到廣泛認(rèn)可的學(xué)說(shuō)之一，其認(rèn)為血脂異常在動(dòng)脈粥樣硬化形成和進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，具體過程如下 [7]：
圖1 脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)
動(dòng)脈內(nèi)皮下脂質(zhì)顆粒的蓄積與修飾
血液中脂質(zhì)顆粒的濃度越高，動(dòng)脈內(nèi)皮下越容易蓄積以低密度脂蛋白（Low Density Lipoprotein, LDL）為主的脂質(zhì)顆粒。過多沉積的脂質(zhì)顆粒則需要依賴巨噬細(xì)胞的吞噬而清除。為了區(qū)別于血液中正常運(yùn)行的脂質(zhì)顆粒，便于巨噬細(xì)胞的識(shí)別，內(nèi)皮下的脂質(zhì)顆粒會(huì)與內(nèi)膜下蛋白多糖結(jié)合并發(fā)生聚集，使其更易在酶促反應(yīng)下被氧化或進(jìn)行其它化學(xué)修飾。參與脂質(zhì)顆粒氧化酶有內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的還原型輔酶II氧化酶、巨噬細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生的脂質(zhì)加氧酶和髓過氧化物酶等。
單核細(xì)胞的粘附與遷移
在修飾后的脂質(zhì)顆粒等刺激因素的作用下，內(nèi)皮細(xì)胞可產(chǎn)生單核細(xì)胞趨化蛋白-1，選擇性地吸引單核細(xì)胞穿越內(nèi)皮細(xì)胞間隙進(jìn)入內(nèi)皮下的脂質(zhì)顆粒聚集部位。
泡沫細(xì)胞的形成
遷移至內(nèi)皮下的單核細(xì)胞在修飾后的脂質(zhì)顆粒的影響下分化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞通過其表面的清道夫受體識(shí)別并吞噬修飾的脂質(zhì)顆粒，該吞噬過程不受所攝取膽固醇量的調(diào)節(jié)。巨噬細(xì)胞吞噬的脂質(zhì)顆?？赏ㄟ^高密度脂蛋白（High Density Lipoprotein, HDL）轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)皮外，使巨噬細(xì)胞能夠繼續(xù)吞噬脂質(zhì)顆粒，并最終完成清除工作。然而，如果脂質(zhì)顆粒沉積過多，超過HDL的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，巨噬細(xì)胞吞噬的脂質(zhì)就會(huì)不斷增多，形成泡沫細(xì)胞，最終死亡。大量死亡的泡沫細(xì)胞聚集形成脂池，并吸引動(dòng)脈中層的平滑肌細(xì)胞遷移至內(nèi)膜。隨后，平滑肌細(xì)胞由收縮型衍變?yōu)楹铣尚?，并產(chǎn)生大量膠原和彈力纖維等，包裹脂池形成典型的粥樣硬化病變。
PART 02
常見檢測(cè)指標(biāo)
基于脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)，流行病學(xué)、遺傳學(xué)和臨床干預(yù)研究的證據(jù)充分證實(shí)：血脂、脂蛋白和載脂蛋白參與了ASCVD的病理生理過程，是ASCVD的致病性危險(xiǎn)因素［8］。
血脂
血脂是血液中脂類物質(zhì)的總稱，包括總膽固醇（Total Cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）和類脂（如磷脂、糖脂等）等。臨床上血脂檢測(cè)的常規(guī)項(xiàng)目為TC、TG、高密度脂蛋白膽固醇（High Density Lipoprotein Cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（Low Density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C）等，此外，小而密低密度脂蛋白 (small dense Low-Density Lipoprotein Cholesterol，sd LDL-C)和游離脂肪酸（Free fatty acid，F(xiàn)FA）的臨床應(yīng)用價(jià)值也在日益受到關(guān)注。
脂蛋白
脂蛋白是指血液中運(yùn)送水不溶性脂類的超分子組裝體（球狀微粒），由富含膽固醇酯、甘油三酯的疏水性內(nèi)核和由載脂蛋白、單層磷脂、膽固醇等組成的外殼構(gòu)成。
圖2 脂蛋白的結(jié)構(gòu)
脂蛋白根據(jù)其水合密度、顆粒大小和載脂蛋白等的不同，分為乳糜微粒（Chylomicron，CM）、極低密度脂蛋白（Very Low?Density Lipoprotein，VLDL）、中間密度脂蛋白（Intermediate?Density Lipoprotein，IDL）、低密度脂蛋白（Low?Density Lipoprotein，LDL）和高密度脂蛋白（High?Density Lipoprotein，HDL）。如果進(jìn)一步細(xì)分，VLDL可分為5個(gè)亞類（VLDL 1-5），LDL可分為6個(gè)亞類（LDL 1-6），HDL可分為4個(gè)亞類（HDL 1-4），各亞類的表達(dá)與功能不盡一致。此外，在LDL和HDL區(qū)帶之間，還存在一種特殊的脂蛋白—脂蛋白（a）［lipoprotein(a)，Lp(a)］，它是ASCVD的一項(xiàng)獨(dú)立的前瞻性危險(xiǎn)性因素。脂蛋白的物理特性、主要成分、來(lái)源和功能如圖3所示。目前臨床上脂蛋白檢測(cè)的項(xiàng)目為L(zhǎng)p(a)等，但由于脂蛋白在血液中一般呈球狀，不易直接測(cè)定，因此臨床上常通過檢測(cè)血脂和載脂蛋白的含量來(lái)間接了解血液中脂蛋白的含量。
圖3 脂蛋白的物理及生物學(xué)特性和功能
圖表來(lái)源：中華醫(yī)學(xué)會(huì)
載脂蛋白（Apo）
載脂蛋白（Apo）作為脂蛋白的重要組成部分，主要在肝臟（部分在小腸）合成，基本功能是運(yùn)載脂類物質(zhì)及穩(wěn)定脂蛋白的結(jié)構(gòu)，某些載脂蛋白還具有激活脂蛋白代謝酶、識(shí)別受體等功能。迄今已發(fā)現(xiàn)20余種Apo，按ABC系統(tǒng)命名，各類Apo又可細(xì)分為幾個(gè)亞類，以羅馬數(shù)字表示，如AⅠ、AⅡ、AⅣ、AⅤ、B48、B100、CⅠ、CⅡ、CⅢ、D、E、H、J和Apo（a）等。臨床上載脂蛋白檢測(cè)的項(xiàng)目為ApoA Ⅰ、ApoA Ⅱ、ApoB、ApoC Ⅱ、ApoC Ⅲ、ApoE等[9,10]。
在傳統(tǒng)的血脂代謝紊亂治療方案中，主要是讓患者長(zhǎng)期定時(shí)服用降血脂藥物，包括他汀類藥物、貝特類藥物、膽固醇吸收抑制劑、前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（PCSK9）抑制劑、高純度魚油制劑等，以改變血液中的血脂含量。在治療過程中，通過監(jiān)測(cè)上述多個(gè)指標(biāo)的變化實(shí)時(shí)調(diào)整用藥，來(lái)幫助患者進(jìn)行嚴(yán)格的血脂控制，從而避免心腦血管事件的發(fā)生。
PART 03
靶向Lp(a)藥物檢測(cè)指標(biāo)-intact Lp(a)
隨著心血管領(lǐng)域研究的不斷推進(jìn)，對(duì)Lp(a)在心血管疾病中作用機(jī)制的理解也不斷深入，Lp(a)已成為降脂藥研發(fā)的新靶點(diǎn)。目前，全球范圍內(nèi)尚無(wú)靶向Lp(a)的藥物獲批上市，相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)進(jìn)展如下：
圖4 不同類型靶向Lp(a)降脂藥物研發(fā)進(jìn)展
針對(duì)Lp(a)的結(jié)構(gòu)和誘導(dǎo)心血管疾病的病理機(jī)制，藥物研發(fā)方向主要有以下三個(gè)：
?
限制Apo(a)的合成[11]：使用小干擾RNA（siRNA）藥物來(lái)靶向抑制編碼Apo(a)的LPA基因的表達(dá)，如Lepodisiran Sodium、Olpasiran、Zerlasiran；或者是使用靶向LPA基因的反義寡核苷酸（ASO）藥物來(lái)抑制合成，如Pelacarsen、IONIS-APO(a)Rx。
?
限制Lp(a)的組裝[12]：使用小分子藥物與Apo(a)的初始非共價(jià)鍵KIV7和KIV8結(jié)合，從而阻斷Apo(a)和ApoB連接過程，進(jìn)而抑制Lp(a)形成[13]，如LY3473329。
?
持續(xù)降低Lp(a)合成：使用CRISPR-gRNA-Cas9核酸酶脂質(zhì)納米粒制劑來(lái)靶向編輯Lp(a)基因，從而降低Lp(a)水平，如CTX-320。
Lp(a)由Apo(a)和包含載脂蛋白B-100(ApoB-100)的LDL類似顆粒按1：1的比例，通過二硫鍵連接而成，詳見圖5[14]。Apo(a)由肝細(xì)胞合成分泌，是一種高度多態(tài)性的親水性糖蛋白，包含被稱為Kringle的環(huán)狀蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，含有Kringle 4(KⅣ)型和Kringle 5(KV)型兩種結(jié)構(gòu)域。KⅣ有10種類型結(jié)構(gòu)，KⅣ-2結(jié)構(gòu)的重復(fù)次數(shù)由遺傳決定且差異巨大，從而導(dǎo)致Apo(a)大小的多態(tài)性，其分子大小跨度在187kDa到662kDa范圍內(nèi)。除上述主體結(jié)構(gòu)以外，Apo(a)還連接有一段無(wú)無(wú)蛋白水解活性的蛋白酶結(jié)構(gòu)域，并且可以與OxPL結(jié)合，具有促炎活性。
圖5 脂蛋白a結(jié)構(gòu)
由于Apo(a)的大小特異性，當(dāng)采用針對(duì)KⅣ-2區(qū)域的抗體檢測(cè)時(shí)，若患者的Apo(a)分子小于校準(zhǔn)液中使用的Apo(a)分子，就會(huì)得到低于患者實(shí)際Lp(a)水平的結(jié)果，反之則高于。因此，傳統(tǒng)的Lp(a)檢測(cè)方法一般使用多克隆抗人Lp(a)兔抗來(lái)檢測(cè)Lp(a)，以避免KⅣ-2結(jié)構(gòu)重復(fù)次數(shù)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。同時(shí)該方法溯源至WHO/IFCC 國(guó)際參考試劑(SRM2B)，從而實(shí)現(xiàn)Lp(a)測(cè)量的準(zhǔn)確性和標(biāo)準(zhǔn)化。但由于該方法實(shí)際檢測(cè)的是Apo(a)分子，因此無(wú)法區(qū)分游離的Apo(a)和Lp(a)分子。在常規(guī)情況下，血清中游離的Apo(a)分子僅占總Apo(a)分子的5%，因此對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著影響；但使用了靶向Lp(a)藥物的患者，尤其是使用了限制Lp(a)組裝的小分子藥物的患者，其血液中的Apo(a)分子的分布比例會(huì)產(chǎn)生顯著變化。因此傳統(tǒng)方法檢測(cè)獲得的結(jié)果可能高于實(shí)際結(jié)果，從而低估藥物的療效。故針對(duì)此類藥物，應(yīng)當(dāng)檢測(cè)intact Lp(a)，即完整的Lp(a)。
PART 04
常用檢測(cè)方法
不同的檢測(cè)指標(biāo)，所選用的檢測(cè)方法各不相同，主要分為酶比色法、免疫比濁法和Elisa法。
酶比色法
主要是將靶標(biāo)物質(zhì)和底物共同孵育，經(jīng)過酶促氧化，生成有特定顏色的產(chǎn)物，在一定波長(zhǎng)下，形成特定的吸收峰，從而檢測(cè)靶標(biāo)物質(zhì)的濃度。常用的檢測(cè)項(xiàng)目主要為血脂類。其中，對(duì)于LDL-C、HDL-C和sd LDL-C這類需要進(jìn)行區(qū)分檢測(cè)的靶標(biāo)物質(zhì)，在孵育前會(huì)使用特定的表面活性劑來(lái)選擇性地溶解除靶標(biāo)物質(zhì)以外的脂類，并提前氧化分解，避免對(duì)靶標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)產(chǎn)生影響。隨后再溶解靶標(biāo)物質(zhì)中的脂類，進(jìn)行酶比色法檢測(cè)。
免疫比濁法
主要通過抗原抗體的免疫反應(yīng)，形成不溶的復(fù)合物，從而產(chǎn)生濁度，進(jìn)而檢測(cè)靶標(biāo)物質(zhì)的濃度。常用的檢測(cè)項(xiàng)目主要為載脂蛋白類。其中，對(duì)于Lp(a)這類對(duì)靈敏度要求較高的靶標(biāo)物質(zhì)，會(huì)將抗體交聯(lián)在乳膠微球上，從而促進(jìn)抗原抗體的交聯(lián)，使其在低濃度下即可產(chǎn)生濁度，顯著提升檢測(cè)靈敏度。
Elisa法
主要根據(jù)雙抗夾心的檢測(cè)原理，對(duì)靶標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。常用的檢測(cè)項(xiàng)目多為與藥物相關(guān)的檢測(cè)指標(biāo)，如intact Lp(a)。使用抗Apo(a)抗體和抗ApoB 100抗體對(duì)Lp(a)進(jìn)行檢測(cè)，從而確保檢測(cè)的是Lp(a)的完整結(jié)構(gòu)，其結(jié)果不會(huì)受游離的Apo(a)和ApoB 100的影響。對(duì)于此類指標(biāo)，可以同時(shí)輔以傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，對(duì)二者數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，從而確證藥物的療效。但比較過程中，需要保證兩個(gè)方法的溯源一致，否則可能由于抗體特異性等原因，導(dǎo)致最終結(jié)果差異顯著，無(wú)法比較。
熙寧|精翰在生物血液樣品中與ASCVD相關(guān)生物標(biāo)志物的檢測(cè)方法開發(fā)、驗(yàn)證和樣品分析方面擁有豐富的經(jīng)驗(yàn)，可提供抗血脂、載脂蛋白、脂蛋白等一系列的藥效學(xué)分析服務(wù)，歡迎后臺(tái)留言咨詢。
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