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細(xì)胞與基因治療領(lǐng)域近年來取得了令人矚目的突破，在惡性腫瘤、遺傳病、罕見病等治療中展現(xiàn)出巨大潛力，為眾多患者帶來了新希望。隨著CAR-T療法、基因編輯技術(shù)、溶瘤病毒等創(chuàng)新療法相繼獲批上市，細(xì)胞與基因治療的臨床應(yīng)用愈發(fā)廣泛。
PART 01
細(xì)胞與基因治療安全性風(fēng)險及合規(guī)性要求
細(xì)胞與基因治療產(chǎn)品通常借助病毒或非病毒載體，將外源基因?qū)氚屑?xì)胞或組織，以實現(xiàn)基因替代、補(bǔ)償、修正或敲除等治療目的。但是，病毒或非病毒載體在宿主基因組中的隨機(jī)整合，可能引發(fā)插入性突變，進(jìn)而導(dǎo)致克隆擴(kuò)增甚至腫瘤形成。BluebirdBio的體外干細(xì)胞基因治療產(chǎn)品SKYSONA，用慢病毒載體導(dǎo)入外源基因，治療腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良。開發(fā)過程中有 3例兒童被診斷出骨髓增生異常綜合征（Myelodysplastic Syndrome，MDS），其中2例因慢病毒整合到原癌基因的克隆擴(kuò)增所致 [1] 。2023年7月起，F(xiàn)DA調(diào)查已獲批上市的6款CAR-T產(chǎn)品治療后發(fā)生T淋巴細(xì)胞瘤的情況，確定這些CAR-T療法存在繼發(fā)性 T 細(xì)胞惡性腫瘤風(fēng)險。對3例接受CAR-T治療后發(fā)生癌變的患者基因測序，發(fā)現(xiàn)惡性細(xì)胞克隆中存在CAR基因。2024年4月18日，F(xiàn)DA正式要求更新黑框警告，提醒患者和處方醫(yī)師相關(guān)風(fēng)險，要求患者和臨床試驗參與者終身監(jiān)測 [2-3] 。
因此，整合位點分析作為一項關(guān)鍵技術(shù)，在評估細(xì)胞與基因治療產(chǎn)品的安全性方面發(fā)揮著舉足輕重的作用。它不僅是合規(guī)要求，更是保障細(xì)胞與基因治療長期安全性的關(guān)鍵工具。中國CDE和美國FDA等各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)，已發(fā)布多項指導(dǎo)文件，明確要求開展整合位點分析，以評估插入性突變的風(fēng)險。在藥學(xué)和非臨床安全性研究階段，需要關(guān)注基因整合情況、插入位點和拷貝數(shù)，分析基因組改變特征，評估潛在風(fēng)險。在臨床研究階段，需要長期隨訪監(jiān)測克隆形成和繼發(fā)腫瘤風(fēng)險。整合位點分析不僅助力申辦方滿足法規(guī)要求，更為產(chǎn)品的上市和臨床推廣提供了有力支持。
PART 02
整合位點檢測和分析方法解析
隨著高通量測序與生物信息學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展，整合位點檢測與注釋分析已可以為理解和判斷風(fēng)險提供重要的數(shù)據(jù)信息?，F(xiàn)有的整合位點的檢測多是基于分子生物學(xué)的方法，包括線性擴(kuò)增介導(dǎo)的PCR（Linear Amplification-mediated PCR，LAM-PCR）、非限制性線性擴(kuò)增介導(dǎo)的PCR（Non-restrictive Linear Amplification-mediated PCR, nrLAM-PCR）、連接介導(dǎo)的PCR（Ligation-mediated PCR，LM-PCR）、靶向富集測序（Target Enrichment Sequencing，TES）和全基因組測序（Whole Genome Sequencing, WGS）。其優(yōu)缺點比較如下表：
表1 整合位點檢測方法學(xué)比較
整合位點測序的數(shù)據(jù)有許多公共的分析方法或軟件供使用，如INSPIIRED、PIC、IS-Seq和VISPA2等，可分析整合位點在基因組中的位置、分布、功能區(qū)，以及癌基因與非癌基因偏好性和多樣性指數(shù)（如Chao1、香農(nóng)指數(shù)、基尼系數(shù)和UC50等），綜合評估整合位點安全性風(fēng)險。
隨著細(xì)胞與基因治療從腫瘤向自身免疫疾病適應(yīng)癥的拓展，整合位點分析將在療法安全性的縱向監(jiān)測中發(fā)揮更為關(guān)鍵的作用，為保障患者安全、推動細(xì)胞與基因治療領(lǐng)域的健康發(fā)展持續(xù)貢獻(xiàn)力量。
PART 03
精翰生物整合位點檢測介紹
精翰生物具備細(xì)胞與基因治療中常見的慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和非病毒載體（如轉(zhuǎn)座子等）等整合位點檢測和分析的能力。精翰生物的整合位點檢測方法具有自主知識產(chǎn)權(quán)，自主設(shè)計錨定接頭和引物，基于LM-PCR（Ligation-mediated PCR）的原理，針對載體LTR/ITR（Long terminal repeats/Inverted terminal repeats）區(qū)域進(jìn)行2輪巢式PCR擴(kuò)增，經(jīng)過測序和生信分析，識別整合位點的位置、分布和所在功能區(qū)，并對偏好性和多樣性進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。此外，接頭中還設(shè)計了分子標(biāo)簽（Unique molecular identifier，UMI），可以實現(xiàn)整合位點相對豐度的計算。有利于識別異常的單克隆或寡克隆。LM-PCR也是FDA獲批藥物評審報告中推薦的檢測方法 [4] 。
精翰生物慢病毒整合位點檢測已完成性能驗證，全面支持全血、細(xì)胞注射液和DNA等樣本的檢測，具備豐富的經(jīng)驗，成功支持了多家申辦方的IND申報、注冊臨床和長期隨訪，助力細(xì)胞與基因治療藥物的安全性檢測。
圖1 LM-PCR建庫原理示意圖
參考文獻(xiàn)：
[1] FDA. Cellular, Tissue, and Gene Therapies Advisory Committee Meeting [EB/OL]. 2022-06-09 [2024-10-24]. https://www.fda.gov/media/159010/download
[2] VERDUN N, MARKS P. Secondary Cancers after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy[J]. N Engl J Med. 2024, 390(7): 584-586.
[3] FDA. FDA Requires Boxed Warning for T cell Malignancies Following Treatment with BCMA-Directed or CD19-Directed Autologous Chimeric Antigen Receptor (CAR) T cell Immunotherapies [EB/OL]. 2024-04-18 [2024-10-24].
[4] FDA. Cellular, Tissue, and Gene Therapies Advisory Committee Meeting [EB/OL]. 2022-06-09 [2024-10-24]. https://www.fda.gov/media/159011/download
[5] 李振東,鐘振鵬,董風(fēng)晴,等.細(xì)胞與基因治療產(chǎn)品評價中的基因組整合位點檢測與分析[J].中國臨床藥理學(xué)雜志,2025,41(07):1013-1019.
