免疫組庫測序在各種疾病研究中顯示出良好的前景，如自身免疫性疾病、傳染病、腫瘤的診斷、監(jiān)測和治療等，免疫組庫測序。作為當下備受矚目的前沿技術之一，正為我們揭開免疫系統(tǒng)奧秘的面紗。免疫組庫測序不僅讓我們能夠深入了解身體對抗病原體的方式，更為理解免疫相關疾病和藥物研發(fā)提供了新的視角。本文旨在向大家介紹什么是免疫組庫測序，無論您是否對生物科學有著濃厚興趣，本文都將為您打開一扇通往免疫學世界的門，讓我們一起探尋人類抵御疾病的絕妙之處吧！

PART 01

免疫系統(tǒng)保護人體免受病原體的傷害，這種保護主要為大量淋巴細胞受體、T細胞受體（T cell receptor, TCR）和B細胞受體（B-cell receptor, BCR）誘導的免疫反應。免疫受體是抗原結合的重要結構域，共有七條鏈參與形成受體，T細胞包括由α鏈和β鏈編碼的αβT細胞或由γ鏈和δ鏈編碼的γδT細胞，B細胞受體由重鏈和κ鏈或重鏈和λ鏈編碼，還有雙α和雙γT細胞，這些受體有助于確定抗原特異性。在任何特定時刻，一個人的免疫系統(tǒng)都由獨特的TCR和BCR組成，這反映了免疫系統(tǒng)對毒素或外來物質的反應能力（圖1） 。

免疫組庫測序是指檢測BCR及TCR，B細胞上負責識別并特異結合抗原的膜表面免疫球蛋白，我們稱為BCR，BCR是由兩條重鏈和兩條輕鏈組成；T細胞上特異識別并特異結合抗原的分子為TCR，TCR分子也屬于免疫球蛋白超家族, 由α、β或γ、δ兩條肽鏈組成。編碼BCR/TCR的4個基因簇V(可變區(qū))、D（高變區(qū)）、J（編碼蛋白連接v、c區(qū)的結合區(qū)）、C（恒定區(qū)） ， B/T細胞通過V(D)J重組，使BCR/TCR基因序列極為豐富。V(D)J序列多樣性的集合我們稱為為免疫組庫（Immune Repertoire, IR）,通過高通量測序，可一次性獲得大量免疫組庫數(shù)據(jù)，從而實現(xiàn)免疫組庫高通量測序。

圖1 抗原特異性淋巴細胞受體的結構和多樣性^[1]

注：上圖顯示了抗體的重鏈和輕鏈，它們通過二硫鍵連接（粗藍線）；跨細胞膜的TCR是由αβ鏈或γδ鏈組成的異二聚體。上圖中由V（D）J基因組成的可變（V）區(qū)，V區(qū)由CDR區(qū)和框架區(qū)（FR）組成。CDR1、CDR2和CDR3顯示為不同的顏色（分別為黃色、藍色和綠色）。下部（白色區(qū)域）是一個保守的恒定區(qū)域

圖2 淋巴細胞受體庫多樣性的機制^[1]

注：在淋巴細胞發(fā)育過程中，BCR重鏈或TCRβ（δ）鏈進行VDJ基因的重排，而IgL鏈或α（γ）鏈在重排中缺少D基因；然后，將重新排列的V-DJ或V-J序列連接到C基因片段。最后，兩條獨立的鏈被組裝成獨特的受體蛋白。胚系基因V（D）JC經歷核苷酸的重排、插入和刪除，導致受體庫的多樣性

PART 02

TCR 是由 α 和 β 鏈 （TCRαβ） 或 γ 鏈和 δ 鏈 （TCRγδ） 組合形成的跨膜糖蛋白異二聚體。它們僅在 T 細胞中表達，其中大多數(shù) （95%） 為 TCRαβ 異二聚體。TCRα 和 TCRβ 胞外結構域由肽段識別至關重要的可變結構域（Vα 和 Vβ）和恒定結構域（Cα 和 Cβ）組成。

編碼α鏈和β鏈（分別為 TRA 和 TRB）的基因由多個不連續(xù)的片段組成：TRA 和 TRB 的可變區(qū) （V） 和連接區(qū) （J），以及 TRB 的多樣性 （D） 片段。TCR 基因經歷 V（D）J 重組：α 鏈的 V 和 J 片段以及 β 鏈的 V、D 和 J 片段間重組，形成功能可變的編碼序列。然后，該序列與 C 片段重組，并最終轉錄為功能性 TRA 或 TRB 鏈轉錄本。TCRα和TCRβ鏈的結構中都包含三個高變區(qū)，分別稱為互補決定區(qū)1、2和3（CDR1、CDR2、CDR3）。CDR1 和 CDR2 區(qū)域由 V 段胚系基因編碼，CDR3區(qū)由連接區(qū)V（D）J基因編碼，片段間伴有核苷酸（N）隨機插入/刪除，為該區(qū)域提供高度的變異性。這些過程最終產生由特定α和β鏈組成的 TCR，這些鏈決定了受體的特異性（圖3）。

PART 03

人類的抗體是蛋白質復合物，其基本單位是一對二硫鍵連接的重鏈蛋白和一條對應的輕鏈（圖3）。重鏈和輕鏈的N末端區(qū)域的序列高度可變，并且是抗體的抗原結合部位。蛋白質的C末端區(qū)域被稱為恒定區(qū)域。輕鏈有兩種類型，kappa (IgK) 和lambda (IgL)，而重鏈（IgH）有五種主要的類型（IgM、IgD、IgG、IgA和IgE），其中IgG有四種亞型，IgA有兩種亞型。

為了識別不同的抗原，在每個B細胞中，Ig基因經歷兩次多樣化過程，包括抗原非依賴性和抗原依賴性過程，最后形成總的BCR抗體庫。

在暴露于抗原之前，V（D）J重組發(fā)生在網膜、胎兒肝臟或成人骨髓中的B細胞發(fā)育過程中，IgV外顯子重排組裝形成一級抗體庫。在這種不依賴抗原的過程中，胚系可變區(qū)（V）、高變區(qū)（D）和連接區(qū)（J）基因片段以有序的方式在Ig基因座中重排組裝而成，首先將D和J片段連接在一起，然后選擇V片段連接到新產生的D-J產物，從可變（V）、高變區(qū)（D）和連接區(qū)（J）基因片段胚系序列中組裝編碼其免疫球蛋白重鏈的抗原結合區(qū)的基因。在連接過程中，對基因片段的末端進行核酸外切酶消化，并在片段連接處添加非模板隨機堿基（N）。初級BCR庫的多樣性來自V/D/J基因片段的數(shù)量，以及連接點的插入和刪除（indel）突變。在IgV結構域中，該序列可進一步分為互補決定區(qū)（CDR）和框架區(qū)（FR）。FR和CDR1/2來自V基因片段，而CDR3覆蓋包含V-D-J連接的序列（圖3）。因此，CDR3是最多樣化的序列，通常在抗原識別過程中發(fā)揮最重要的作用，但由可變基因片段編碼的另外兩個結構域（CDR1和CDR2）也可以顯著促進抗原特異性。從肽序列方面來看，CDR3有以下幾個特征，即，以半胱氨酸（C）開始，以苯丙氨酸（F）或色氨酸（W）結束。 在表達功能性IgH后，κ或λ免疫球蛋白輕鏈基因座上發(fā)生類似的V和J片段重排。

在暴露于抗原之前，個體B細胞抗體庫的遺傳復雜性來源于V、（D）和J片段的重排組合，編碼抗體重鏈或輕鏈的CDR3區(qū)域片段連接處的多樣化，以及重鏈和輕鏈的配對組合。早期對這些機制可能產生的不同抗體的數(shù)量的粗略估計為大于1011。這個數(shù)字應該是被低估了，因為抗原刺激下B細胞激活體細胞超突變?yōu)榭贵w序列多樣化提供了更多可能，該過程是在整個重排的V（D）J序列中產生新的點突變，形成克隆后代，其抗體可能對抗原具有更強的結合親和力；另外受體編輯等罕見過程通過V基因片段的二次重排和替換，為抗體庫的生成提供了進一步的可能。在人類群體水平上，抗體庫的更多遺傳多樣性源于免疫球蛋白等位基因突變和免疫球蛋白基因座內擴增或刪除的拷貝數(shù)變異。

V基因片段的遺傳結構包括編碼大部分前導肽的上游外顯子，其次是短內含子、編碼其余前導肽和V片段的第二外顯子。在未重排的人類胚系基因座中，V、D和J區(qū)域彼此相隔數(shù)千堿基，由單個外顯子（κ或λ）或幾個外顯子編碼的恒定區(qū)域（重鏈不同類型）位于J片段下游數(shù)千堿基處，除λ基因座外，其中一些J片段散布在最上游的恒定區(qū)域之間。在重鏈和輕鏈基因座重排過程中產生長度約為400個堿基緊湊的V（D）J基因。

根據(jù)IMGT數(shù)據(jù)庫（www.IMGT.org）報道，14q32人類IGH基因座的序列分析表明，人類具有123-129個IGHV基因片段，其中43-46個能夠形成功能重排；27個IGHD基因片段（23個功能片段）；以及9個IGHJ片段（6個功能性片段）。2p11的IGK基因座在大多數(shù)個體中編碼76個IGKV片段（31-36個功能性片段）和5個IGKJ基因片段（5個功能性片段），而22q11的IGL基因座包含73-74個IGLV片段（29-33個功能性片段）和7-11個IGLJ片段（4-5個功能性片段）。隨著技術的發(fā)展，識別Ig基因新變異的步伐已經加快，這表明目前分析的變異只代表了所有人類群體中可能存在的總變異的一部分。

抗原刺激后，BCR經歷另一次多樣化，包括IgH類開關重組（CSR）和IgV體細胞超突變（SHM），這兩種突變都是由激活誘導的胞苷脫氨酶（AID）引發(fā)。在CSR中，BCR可以從IgM轉換到另一種同種型，包括IgG、IgA或IgE。而在SHM中，AID可以在IgV外顯子處啟動突變或INDEL。表達突變多樣性BCR的B細胞在生發(fā)中心的次級淋巴結構中進行親和力的選擇，該過程為親和力成熟的過程。伴隨著這些抗原依賴性過程，幼稚B細胞進一步分化為分泌抗體的漿細胞或記憶B細胞。此時，B細胞庫表達高級抗體庫，其中包含不同類別的高效抗體。人類抗體的體細胞超突變主要發(fā)生在次級淋巴組織的特殊微環(huán)境中，其中B細胞可以接觸抗原、特異樹突狀細胞、基質細胞和T細胞，以及通過可溶性介質和細胞-細胞接觸刺激B細胞。在急性抗原刺激（如流感疫苗接種）后觀察到的人漿母細胞在IGHV片段中通常顯示出5%-15%的突變水平，而記憶B細胞顯示出略低的突變水平。在特殊的情況下，如HIV感染者長期暴露于病毒抗原免疫系統(tǒng)紊亂時，可以觀察到更高的突變水平（超過30%）。突變事件主要集于前導序列的上游至V（D）J重排的區(qū)域，并在將J片段與恒定區(qū)域之間的內含子區(qū)中逐漸變少。

圖4 抗體結構和基因編碼^[3]

注：免疫球蛋白重鏈基因座的胚系（未重排）基因組DNA結構如圖頂部所示，顯示了 V、D 和 J 基因片段的串聯(lián)排列（非等比例縮放）。胚系κ或λ輕鏈基因座位于左側，具有未重排的V和J片段。胚系DNA的逐步重排使重鏈D和J基因片段的連接，隨后V片段與D-J產物的連接，產生編碼重鏈可變區(qū)的DNA。在重排過程中，基因片段的末端經過核酸外切酶消化，并在片段末端添加隨機的非模板堿基，以在編碼互補決定區(qū)3（CDR3）的VDJ連接區(qū)產生額外的序列多樣性，其通常是抗體重鏈中對抗原特異性影響最大的區(qū)域。在輕鏈基因座中發(fā)生了類似的V和J基因重排過程，VJ連接多樣化，從而產生重排的輕鏈基因。重鏈和輕鏈的恒定區(qū)（重鏈結構域CH1、CH2和CH3，輕鏈結構域CL）由下游外顯子編碼，這些外顯子通過mRNA剪接與重排的V（D）J基因連接。抗體結構中蛋白鏈連接的二硫鍵用黑線顯示。

本篇內容給大家介紹了什么是免疫組庫測序，詳細介紹了BCR/TCR基因重排的過程，下篇將為大家介紹免疫組庫測序的方法，敬請期待。

參考文獻：

[1] Liu H, Pan W, Tang C, Tang Y, Wu H, Yoshimura A, Deng Y, He N, Li S. The methods and advances of adaptive immune receptors repertoire sequencing. Theranostics. 2021 Aug 19;11(18):8945-8963. doi: 10.7150/thno.61390. PMID: 34522220; PMCID: PMC8419057.

[2] Aran A, Garrigós L, Curigliano G, Cortés J, Martí M. Evaluation of the TCR Repertoire as a Predictive and Prognostic Biomarker in Cancer: Diversity or Clonality? Cancers (Basel). 2022 Mar 31;14(7):1771. doi: 10.3390/cancers14071771. PMID: 35406543; PMCID: PMC8996954.

[3] Boyd SD, Joshi SA. High-Throughput DNA Sequencing Analysis of Antibody Repertoires. Microbiol Spectr. 2014 Oct;2(5). doi: 10.1128/microbiolspec.AID-0017-2014. PMID: 26104353.

[4] Li N, Yuan J, Tian W, Meng L, Liu Y. T-cell receptor repertoire analysis for the diagnosis and treatment of solid tumor: A methodology and clinical applications. Cancer Commun (Lond). 2020 Oct;40(10):473-483. doi: 10.1002/cac2.12074. Epub 2020 Jul 17. PMID: 32677768; PMCID: PMC7571402.

[5] Joshi K, Milighetti M, Chain BM. Application of T cell receptor (TCR) repertoire analysis for the advancement of cancer immunotherapy. Curr Opin Immunol. 2022 Feb;74:1-8. doi: 10.1016/j.coi.2021.07.006. Epub 2021 Aug 25. PMID: 34454284.

[6] 12 Zhang S, Yang T, Liu X, Yang J, Zheng X. Antibody repertoire sequencing analysis. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2022 May 25;54(6):864-873. doi: 10.3724/abbs.2022062. PMID: 35713313; PMCID: PMC9828323.

[7] Nixon AB, Schalper KA, Jacobs I, Potluri S, Wang IM, Fleener C. Peripheral immune-based biomarkers in cancer immunotherapy: can we realize their predictive potential? J Immunother Cancer. 2019 Nov 27;7(1):325. doi: 10.1186/s40425-019-0799-2. PMID: 31775882; PMCID: PMC6880594.

[8] Schrama D, Ritter C, Becker JC. T cell receptor repertoire usage in cancer as a surrogate marker for immune responses. Semin Immunopathol. 2017 Apr;39(3):255-268. doi: 10.1007/s00281-016-0614-9. Epub 2017 Jan 10. PMID: 28074285.

[9] Porciello N, Franzese O, D'Ambrosio L, Palermo B, Nisticò P. T-cell repertoire diversity: friend or foe for protective antitumor response? J Exp Clin Cancer Res. 2022 Dec 22;41(1):356. doi: 10.1186/s13046-022-02566-0. PMID: 36550555; PMCID: PMC9773533.