前言

地球上病毒數(shù)不勝數(shù)，目前已被人類鑒定出的病毒超過(guò)5000種。自人類起源起，人類與病毒展開(kāi)了激烈的交鋒。雖然人類醫(yī)學(xué)取得長(zhǎng)足的進(jìn)步，但面對(duì)病毒，往往還是沒(méi)有特效藥，一般通過(guò)疫苗免疫，或者通過(guò)藥物抑制病毒復(fù)制，從而減輕癥狀。近年來(lái)，中和抗體類藥物逐漸展現(xiàn)了在病毒治療中的潛力，包括HIV廣譜中和抗體，再到再生元公司開(kāi)發(fā)的全球首款抗埃博拉病毒藥中和抗體雞尾酒療法Inmazeb，以及目前研究火熱的新冠中和抗體藥物。

中和抗體（Neutralizing antibody），是由適應(yīng)性免疫應(yīng)答細(xì)胞分泌的一種可溶性蛋白，其作用機(jī)理如圖1所示，此類藥物大多靶向病毒受體結(jié)合域，通過(guò)阻斷病毒與人體正常細(xì)胞之間的相互作用來(lái)防止病毒感染人體細(xì)胞。藥物上市前需要進(jìn)行非臨床和臨床試驗(yàn)，對(duì)藥物安全性和有效性進(jìn)行評(píng)估。中和抗體藥物屬于大分子蛋白類，檢測(cè)藥物濃度主要是配體結(jié)合法（LBA）。隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展和廣泛應(yīng)用，本文介紹基于LC-MS/MS檢測(cè)中和抗體藥物濃度的方法。

圖1 

質(zhì)譜檢測(cè)蛋白類藥物一般主要分為變性，還原，烷基化，酶解等步驟，如圖2所示。根據(jù)不同待測(cè)物的性質(zhì)，靈敏度要求和干擾情況，還可以增加其他的前處理方式，比如在樣品變性和（或）上樣前進(jìn)行純化，來(lái)提高靈敏度和降低干擾的影響。在針對(duì)蛋白質(zhì)前處理和檢測(cè)進(jìn)行詳細(xì)的介紹之前，我們先對(duì)比一下LCMS與LBA在應(yīng)用于抗體檢測(cè)的區(qū)別。如圖3所示，首先是靈敏度，如果單純從PK分析角度考慮，LCMS方法同樣可以滿足常規(guī)抗體檢測(cè)的需求；其次是特異性，質(zhì)譜的特點(diǎn)的就是專屬性強(qiáng)，它可以通過(guò)選擇特異性肽段來(lái)進(jìn)行定量，所以這種方法相較傳統(tǒng)LBA方法能夠更好的避免干擾的影響；第三是關(guān)鍵試劑，質(zhì)譜方法比LBA方法對(duì)于關(guān)鍵試劑的依賴程度低；第四個(gè)是方法開(kāi)發(fā)時(shí)間，由于質(zhì)譜檢測(cè)可能不需要特殊的關(guān)鍵試劑，且方法開(kāi)發(fā)流程相對(duì)簡(jiǎn)單，在方法開(kāi)發(fā)耗時(shí)上有一定優(yōu)勢(shì)；最后一個(gè)是線性范圍，質(zhì)譜檢測(cè)線性范圍一般是500~1000倍，相比LBA要高的多。除此之外還有質(zhì)譜可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)待測(cè)物，檢測(cè)效率高等諸多特點(diǎn)。下面我們?cè)敿?xì)介紹一下抗體前處理方法。 

圖2

圖3 

樣品純化

如果在方法開(kāi)發(fā)階段受到靈敏度和基質(zhì)干擾的影響，可以選擇樣品純化，但這也會(huì)增加實(shí)驗(yàn)成本和操作步驟。一般樣品純化的方式主要有Protein A/G磁珠或者鏈酶親和捕獲。Protein A/G相對(duì)比較簡(jiǎn)單，可以直接使用磁珠進(jìn)行非特異性抓取，這種方法雖然操作比較簡(jiǎn)單，但干擾相對(duì)較大。圖4介紹的是鏈酶親和捕獲的純化方式，首先Biotin標(biāo)記的捕獲試劑與抗體結(jié)合，然后再與鏈酶親和素磁珠結(jié)合從而達(dá)到純化目的，這種方式特異性強(qiáng)，樣品純化程度高，干擾小。

圖4

變性

抗體屬于蛋白，擁有多重空間折疊結(jié)構(gòu)，因此樣品純化完成后，需要進(jìn)行蛋白變性，打開(kāi)空間結(jié)構(gòu)。常見(jiàn)蛋白變性的主要方式可分為，1）高溫，例如95℃；2）有機(jī)試劑，例如甲醇；3）強(qiáng)酸，例如高氯酸、三氯乙酸；4）蛋白變性劑，例如RapiGest SF，鹽酸胍，尿素。在這些方法中也需要考慮一些問(wèn)題，比如加入蛋白變性劑后對(duì)于后續(xù)酶解使用的蛋白酶活性可能產(chǎn)生很大的影響，從而影響酶解效率。因此可能需要脫鹽處理，或者進(jìn)行稀釋降低對(duì)酶活性影響。

還原、烷基化

由于抗體通過(guò)二硫鍵的形式連接，因此打開(kāi)二硫鍵能更加徹底的分解抗體，一般使用到像DTT或TCEP這樣的還原劑。DTT需要在堿性條件下才能發(fā)揮作用，穩(wěn)定性較差，而TCEP作為還原劑不管是酸性或堿性條件下都可以發(fā)揮還原作用，同時(shí)也具有較高的穩(wěn)定性。打開(kāi)二硫鍵后裸露巰基還是會(huì)再次形成二硫鍵，因此需要保護(hù)巰基。通過(guò)加入的碘乙酰胺與巰基發(fā)生烷基化，從而避免二硫鍵的形成，還原、烷基化過(guò)程見(jiàn)圖5。這一步驟需要注意的是處理?xiàng)l件，像DTT需要在堿性條件下發(fā)揮作用；由于碘乙酰胺的穩(wěn)定性問(wèn)題，需要在避光條件下反應(yīng)。此外還需要關(guān)注試劑的儲(chǔ)存條件和有效期等等。

圖5

酶解

酶解反應(yīng)決定了質(zhì)譜檢測(cè)的檢測(cè)物，最常使用胰酶作為酶解工具，它能夠精準(zhǔn)剪切賴氨酸和精氨酸，產(chǎn)生比較固定的肽段。此外還可使用木瓜蛋白酶，這是一個(gè)廣泛特異性酶，除了能夠剪切賴氨酸精氨酸，還能剪切甘氨酸和瓜氨酸。酶解反應(yīng)這一步主要需要考慮反應(yīng)條件和時(shí)間，比如最適宜的pH和溫度，一般我們常使用37℃反應(yīng)2小時(shí)或過(guò)夜反應(yīng)。

酶解后產(chǎn)生許多多肽碎片，如何去確定是抗體特異性肽段。通常會(huì)使用到一些數(shù)據(jù)庫(kù)，例如Peptide MS Fingerprinter，Skyline，MRMAid。可以通過(guò)軟件設(shè)定酶解酶，以確定產(chǎn)生一級(jí)和二級(jí)離子碎片。選擇肽段主要需要考慮是能夠滿足靈敏度檢測(cè)要求，特異性高干擾小，還有多肽本身穩(wěn)定性，同時(shí)能產(chǎn)生穩(wěn)定的信號(hào)響應(yīng)。

方法學(xué)驗(yàn)證

對(duì)于方法學(xué)驗(yàn)證，一般小分子化藥遵循各國(guó)法規(guī)單位發(fā)布的生物分析指導(dǎo)原則，但是針對(duì)抗體LC-MS檢測(cè)方法，暫時(shí)沒(méi)有相關(guān)的指導(dǎo)原則，目前可參考的主要是“2021 White Paper on Recent Issues in Bioanalysis”，其驗(yàn)證項(xiàng)接受標(biāo)準(zhǔn)可參考配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，從我們實(shí)驗(yàn)室做的結(jié)果來(lái)看，是完全可以滿足小分子化藥生物分析的接受標(biāo)準(zhǔn)。在驗(yàn)證內(nèi)容方面，除了常規(guī)精密度和準(zhǔn)確度，選擇性，穩(wěn)定性外，我們還需要重點(diǎn)關(guān)注回收率/酶解效率，基質(zhì)效應(yīng)，如果使用磁珠純化，還需要考察捕獲效率，捕獲容量等。

案例討論

根據(jù)抗體氨基酸序列，通過(guò)軟件篩選出可變區(qū)域的數(shù)個(gè)特異性肽段，抗體前處理后通過(guò)質(zhì)譜去確定特異性肽段的子母離子，然后優(yōu)化液相質(zhì)譜條件。由于抗體酶解后會(huì)產(chǎn)出很多肽段，可能存在較大干擾，因此特異性肽段篩選是質(zhì)譜檢測(cè)中最關(guān)鍵的步驟。因此，我們通過(guò)制備空白樣品，進(jìn)一步篩選出一個(gè)不存在明顯干擾的特異性肽段。為了減少實(shí)驗(yàn)操作流程和成本，在滿足靈敏度要求的情況下，該實(shí)驗(yàn)沒(méi)有采用磁珠純化和處理后固相萃取純化的操作步驟。通過(guò)優(yōu)化前處理步驟以及液相質(zhì)譜條件就能達(dá)到非常好的重現(xiàn)性和靈敏度，同時(shí)不存在明顯的基質(zhì)干擾，對(duì)于內(nèi)標(biāo)選擇，本實(shí)驗(yàn)定制了特異性肽段同位素內(nèi)標(biāo)。下面總結(jié)了相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

線性、精密度和準(zhǔn)確度

本實(shí)驗(yàn)線性范圍為100~50000 ng/mL，代表性標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖6，相關(guān)系數(shù)r=0.9998。表明線性關(guān)系良好。

通過(guò)考察3個(gè)分析批，5個(gè)濃度質(zhì)控樣品，用以評(píng)估該方法的精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示批內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度（含LLOQ QC的所有濃度質(zhì)控）準(zhǔn)確度偏差范圍為-7.6~11.1%，%CV最大值為5.8%；批間精密度和準(zhǔn)確度（含LLOQ QC的所有濃度質(zhì)控）準(zhǔn)確度偏差范圍為-3.2~5.4%，%CV最大值為3.3%。 

圖6

選擇性

選擇性考察不同來(lái)源的空白基質(zhì)以及高脂，溶血基質(zhì)，評(píng)估空白基質(zhì)對(duì)待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的干擾。同時(shí)考察了內(nèi)標(biāo)對(duì)待測(cè)物的干擾。圖7（I）為空白基質(zhì)圖譜，圖7（II）為零濃度樣品圖譜；圖7（III）為定量下限和內(nèi)標(biāo)圖譜； 

圖7

基質(zhì)效應(yīng)

在方法開(kāi)發(fā)中發(fā)現(xiàn)，由于方法的特殊性，通過(guò)比較含有基質(zhì)樣品與純?nèi)芤簶悠凡町悂?lái)考察基質(zhì)效應(yīng)差異很大，可能由于純?nèi)芤褐锌贵w藥物非特異性吸附和酶解效率差異。因此，本實(shí)驗(yàn)基質(zhì)效應(yīng)通過(guò)考察了不同來(lái)源的空白基質(zhì)，在三個(gè)濃度下進(jìn)行，比較不同基質(zhì)間是否存在基質(zhì)效應(yīng)。在三個(gè)濃度下，不同來(lái)源基質(zhì)的峰面積比%CV分別為2.6%，1.8%，2.1%。

討論

本實(shí)驗(yàn)考察了線性，精密度，準(zhǔn)確度，選擇性，高脂/溶血基質(zhì)效應(yīng)，稀釋測(cè)試，室溫穩(wěn)定性以及長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性，結(jié)果均符合預(yù)期的接受標(biāo)準(zhǔn)，表明該方法可以用于后續(xù)臨床樣品的檢測(cè)。值得注意的是，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)于試劑的選擇，反應(yīng)條件和時(shí)間，耗材的選擇，盡量保持一致，需要關(guān)注配制試劑的穩(wěn)定性和儲(chǔ)存條件，否則可能會(huì)導(dǎo)致方法重現(xiàn)性不佳；此外，由于樣品前處理操作較為繁瑣，需嚴(yán)格按照方法操作，避免發(fā)生污染，對(duì)操作人員的實(shí)驗(yàn)素質(zhì)提出了一定的要求。

結(jié)束語(yǔ)

熙寧生物質(zhì)譜平臺(tái)能夠提供符合NMPA/FDA/OECD/EMA的各項(xiàng)生物樣品分析服務(wù)，支持小分子藥物、多肽、寡核苷酸、PROTAC、ADC以及大分子抗體等藥物的方法開(kāi)發(fā)、驗(yàn)證和樣品檢測(cè)。平臺(tái)配備了含多套高端液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)和Watson LIMS在內(nèi)的生物分析系統(tǒng)和軟件系統(tǒng)，各種先進(jìn)輔助設(shè)備，不僅可以滿足各類型實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)需求，還極大提高了實(shí)驗(yàn)效率和質(zhì)量。 我們能夠更快、更好為客戶提供專業(yè)的技術(shù)服務(wù)，更高效地幫助客戶進(jìn)行藥品研發(fā)。