前言

隨著CTLA4抗體藥物，PD1抗體藥物， CD3-CD19雙抗blinatumomab，CD3-CD20雙抗Mosunetuzumab等相繼獲批上市，適應(yīng)癥不斷的拓寬，免疫治療在新藥研發(fā)領(lǐng)域深入人心。新的免疫調(diào)節(jié)劑靶點(diǎn)和免疫調(diào)節(jié)劑分子實(shí)體進(jìn)入藥物研發(fā)階段，在關(guān)注其極佳的藥效學(xué)前景的同時(shí)，也需要要考慮其安全性風(fēng)險(xiǎn)。免疫調(diào)節(jié)劑，特別是免疫激動(dòng)劑，CD3 based多特異抗體均屬于臨床高風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品，對(duì)于此類產(chǎn)品IND申報(bào)前，CDE發(fā)布最新版本的《藥物免疫原性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》指出，完整的非臨床評(píng)價(jià)需要整合所有可用的體內(nèi)和體外試驗(yàn)數(shù)據(jù)。除了在常規(guī)的動(dòng)物體內(nèi)毒性試驗(yàn)中進(jìn)行細(xì)胞因子相關(guān)檢測(cè)外，還應(yīng)進(jìn)行體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)。當(dāng)體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果為陰性時(shí)，體外試驗(yàn)陽性結(jié)果可以提示潛在臨床安全風(fēng)險(xiǎn)。體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)該如何做？得到的數(shù)據(jù)該如何解讀？對(duì)于首次人體臨床劑量的選擇有何指導(dǎo)意義？筆者將通過TGN1412引發(fā)的災(zāi)難性的臨床事件以及原因探尋，英國NIBSC 組織國際著名藥企的能力測(cè)評(píng)，以及熙寧的體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)檢測(cè)實(shí)踐三方面對(duì)體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)進(jìn)行介紹說明。

起源：CD28激動(dòng)劑TGN1412臨床事件以及原因探尋

TGN1412是一款靶向T細(xì)胞的共刺激受體CD28的超級(jí)激動(dòng)劑，在2006年該抗體第一次進(jìn)入人體臨床實(shí)驗(yàn)時(shí)，6個(gè)健康的受試者在注射該抗體的90分鐘之內(nèi)便產(chǎn)生了嚴(yán)重的危機(jī)生命安全的細(xì)胞因子風(fēng)暴。開發(fā)該抗體的公司TeGenero Immuno Therapeutics也在一年后宣布破產(chǎn)。事后的分析確認(rèn)用于臨床實(shí)驗(yàn)抗體的成品是符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的，尤其是排除了可能引起細(xì)胞因子風(fēng)暴成因的內(nèi)毒素的污染。這說明在臨床前研發(fā)階段TGN1412的免疫毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)人體內(nèi)的安全性預(yù)測(cè)失敗。這些臨床前的實(shí)驗(yàn)包括體外試驗(yàn)評(píng)估，即體外人和其他物種的PBMC/全血細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞因子釋放的測(cè)定，也包括體內(nèi)試驗(yàn)評(píng)估，即親緣相近的靈長(zhǎng)類哺乳動(dòng)物食蟹猴的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞因子釋放。

關(guān)于TGN1412臨床前研發(fā)階段的體內(nèi)和體外免疫毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)人體內(nèi)的安全性預(yù)測(cè)的失敗原因的探尋，筆者認(rèn)為醫(yī)藥研發(fā)行業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)得到了兩個(gè)非常有價(jià)值的結(jié)論。

第一個(gè)是，對(duì)于免疫激動(dòng)劑，在進(jìn)行臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要對(duì)動(dòng)物進(jìn)行是相關(guān)性界定，采用不相關(guān)性動(dòng)物模型進(jìn)行免疫激動(dòng)劑的藥理毒理評(píng)估將會(huì)重新走上TGN1412的悲劇道路，是需要極力避免的。如圖1，以下是筆者對(duì)于相關(guān)性動(dòng)物的理解：

圖1：相關(guān)性動(dòng)物界定

與非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物（NHPs）相比，人類T細(xì)胞通過T細(xì)胞受體激活后，具有更強(qiáng)的增殖反應(yīng)。具體的原因可能是相對(duì)于非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，人的CD33相關(guān)的siglec糖蛋白有明顯的下調(diào)。CD33-siglec糖蛋白軸具備抑制T細(xì)胞激活的重要調(diào)節(jié)功能?；诖它c(diǎn)，免疫調(diào)節(jié)劑使用非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物（NHPs）進(jìn)行臨床前體內(nèi)的免疫毒性評(píng)估，均有低估其免疫毒性的風(fēng)險(xiǎn)。

第二個(gè)是對(duì)于免疫調(diào)節(jié)劑，體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)該如何進(jìn)行設(shè)計(jì)和試驗(yàn)，才能有效的預(yù)測(cè)或者外推到首次進(jìn)入人體的安全劑量。關(guān)于此點(diǎn)英國NIBSC （National Institute for Biological Standards and Control）組織采用更加相關(guān)性的人PBMC設(shè)計(jì)了6種TGN1412和人PBMC刺激作用模型，如圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TGN1412上臨床前的兩種體外實(shí)驗(yàn)方案（1，2）并不能很好模擬人體內(nèi)TGN1412和與人免疫細(xì)胞的相互作用。體外和體內(nèi)結(jié)果的回顧性比較顯示，體外的4，5，6三種實(shí)驗(yàn)方案（固-液作用模式，合適足夠的TGN1412劑量）可能更加貼近體內(nèi)TGN1412與人免疫細(xì)胞的作用模式。

圖2： TGN1412體外試驗(yàn)的6種模型

筆者認(rèn)為基于免疫調(diào)節(jié)劑調(diào)動(dòng)人體免疫系統(tǒng)的復(fù)雜的相互作用，需要我們對(duì)單一目的的體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行多樣化實(shí)驗(yàn)條件的設(shè)計(jì)，安全性測(cè)定要做全的同時(shí)，也要做多，做到細(xì)致，同時(shí)對(duì)于檢測(cè)數(shù)據(jù)要有專業(yè)化的解讀。

標(biāo)準(zhǔn)化：英國NIBSC組織國際大藥企進(jìn)行的體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)?zāi)芰y(cè)評(píng)

體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)該如何做？結(jié)果的可信度怎么樣？NIBSC在2020年組織了國際上知名大藥企，包括Amgen, Pfizer, Roche,GSK，BMS等共同進(jìn)行了一次能力測(cè)評(píng)和國際協(xié)作研究，并選定了CD3抗體OKT3, CD28抗體TGN1412, CD52抗體Campath-1H作為測(cè)評(píng)的陽性藥物，值得業(yè)界同仁借鑒學(xué)習(xí)，如圖3，以下是筆者對(duì)于試驗(yàn)?zāi)Ｊ降目偨Y(jié)：

圖3：NIBSC免疫調(diào)節(jié)劑體外細(xì)胞因子試驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵?/p>

各大藥企基本達(dá)成了共識(shí)，即應(yīng)該采用多種藥物作用模式進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)劑的體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)，但是各大藥企采用的模式通常不完全一樣，如何確保其采用的模式能夠達(dá)到預(yù)期體內(nèi)安全性風(fēng)險(xiǎn)的目的，得到可信賴的結(jié)果，使用一個(gè)可信的陽性對(duì)照和陰性對(duì)照來確保檢測(cè)平臺(tái)檢測(cè)結(jié)果的可靠性顯得極為重要。由于采用個(gè)體的全血和PBMC進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果通常會(huì)存在個(gè)體差異，檢測(cè)結(jié)果有較大的波動(dòng)范圍，匯集了多個(gè)藥企采集了接近100個(gè)個(gè)體的檢測(cè)數(shù)據(jù)范圍將是一個(gè)很好的判斷體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)結(jié)果是否可靠參考標(biāo)準(zhǔn)，如下圖4所示，采用固相作用模式檢測(cè)陽性對(duì)照對(duì)PBMC刺激作用的體外細(xì)胞因子釋放各細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果如下：

圖4：體外細(xì)胞因子試驗(yàn)NIBSC披露的數(shù)據(jù)

方案設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析：熙寧生物體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)實(shí)踐

免疫調(diào)節(jié)劑的臨床前體外細(xì)胞因子釋放需要基于藥物的作用機(jī)理進(jìn)行方案的設(shè)計(jì)，需要盡可能用體外的方法來模擬體內(nèi)藥物和免疫細(xì)胞的作用模式，這是體外方法能夠有效預(yù)測(cè)體內(nèi)情況的基礎(chǔ)。由于免疫系統(tǒng)互作的復(fù)雜性，不同免疫調(diào)節(jié)劑的作用機(jī)理并不相同，一個(gè)盡可能全面考慮不同藥物作用模式的實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)是得到有效數(shù)據(jù)和進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)。熙寧生物基于對(duì)體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)的深刻認(rèn)知，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道分析，推薦的體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)?zāi)Ｐ秃妥兞咳缦拢?/p>

圖5：熙寧推薦的免疫調(diào)節(jié)劑體外細(xì)胞因子試驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵?/p>

1.藥物作用模式使用液相，濕法包被和干法包被，可以對(duì)藥物作用于靶點(diǎn)是單價(jià)起效，多價(jià)起效，或者Cross-link模式多聚態(tài)起效等藥物作用模式進(jìn)行全面表征。

2.效應(yīng)細(xì)胞至少包括PBMC和全血，可考慮稀釋后全血，全血作為效應(yīng)細(xì)胞更加貼近真實(shí)的生理情況，但是對(duì)免疫調(diào)節(jié)劑的刺激會(huì)比較鈍化；PBMC作為效應(yīng)細(xì)胞對(duì)于免疫調(diào)節(jié)劑的刺激會(huì)比較敏感，通常會(huì)得到陽性的數(shù)據(jù)，稀釋后的全血通常情況下對(duì)于免疫免疫調(diào)節(jié)劑的刺激敏感度是介于全血和PBMC之間。

3.藥物作用測(cè)定濃度選擇在0.25ug/mL-10ug/mL，大致類比于體內(nèi)的藥物濃度12.5ug/KG-500ug/KG, 可根據(jù)藥物計(jì)劃的劑量進(jìn)行進(jìn)一步調(diào)整。

4.陽性對(duì)照選擇CD28抗體TGN1412和CD3抗體OKT3，兩者在臨床試驗(yàn)中證實(shí)有較強(qiáng)的免疫因子釋放，并且兩者對(duì)免疫系統(tǒng)的刺激的作用機(jī)理并不完全相同，可以用于評(píng)估不同的藥物作用模式的異同。

5.細(xì)胞因子根據(jù)《藥物免疫原性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》檢測(cè)IL-2, IL-6, TNFα，IFN-γ，IL10，可采用MSD進(jìn)行多因子檢測(cè)，或者性價(jià)比較高使用ELISA進(jìn)行檢測(cè)。

6.至少進(jìn)行三個(gè)受試者進(jìn)行測(cè)試，每個(gè)受試者均進(jìn)行全血和PBMC的檢測(cè)。

熙寧生物有豐富臨床免疫細(xì)胞藥效學(xué)檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)和臨床前的體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)，根據(jù)上述方案設(shè)計(jì)，進(jìn)行多樣化的藥物作用模式，使用陽性對(duì)照CD28抗體TGN1412和CD3抗體OKT3進(jìn)行測(cè)試，部分檢測(cè)結(jié)果如圖6，如IL2的分泌情況如下：

圖6：體外細(xì)胞因子試驗(yàn)熙寧得到的部分?jǐn)?shù)據(jù)

上述檢測(cè)結(jié)果和NIBSC披露出來的數(shù)據(jù)具備高度一致性，從試驗(yàn)結(jié)果也能得出以下的觀點(diǎn)：

1.多種體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ驮谕环N免疫調(diào)節(jié)劑中，細(xì)胞因子釋放的強(qiáng)度差異非常明顯。

2.不同的免疫調(diào)節(jié)劑在用一種體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ湍Ｐ椭校?xì)胞因子的釋放強(qiáng)度差異明顯。

3.同一種免疫調(diào)節(jié)機(jī)在不同的體外刺激模型中，細(xì)胞因子的釋放強(qiáng)度差異明顯。

不同的免疫調(diào)節(jié)劑在不同的體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭杏胁煌慕Y(jié)果，同時(shí)也能得到一些趨勢(shì)較為一致的結(jié)果，即

1.PBMC作為效應(yīng)細(xì)胞相對(duì)于全血有較強(qiáng)的刺激效果

2.包被相對(duì)于液相有較強(qiáng)的刺激效果

3.干法包被相對(duì)于濕法包被相，在CD28抗體TGN1412中有更強(qiáng)的刺激效果，在CD3抗體OKT3中有較弱的刺激效果，可能跟藥物的作用機(jī)理相關(guān)。

總結(jié)討論：

對(duì)于免疫調(diào)節(jié)劑的臨床前試驗(yàn)，特別是免疫激動(dòng)劑和CD3 Based雙抗來說，動(dòng)物模型往往缺乏相關(guān)性，需使用人的PBMC用體外的檢測(cè)方法有效性評(píng)估和安全性評(píng)估，作為完整的非臨床評(píng)價(jià)最為重要的一部分，如下圖，F(xiàn)DA甚至發(fā)文推薦使用人的免疫細(xì)胞用體外的檢測(cè)方法得到的數(shù)據(jù)作為首次人體用藥劑量的最為參考因素。中國CDE發(fā)布最新版本的《藥物免疫原性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》指出完整的非臨床評(píng)價(jià)需要整合所有可用的體內(nèi)和體外試驗(yàn)數(shù)據(jù)。除了在常規(guī)的動(dòng)物體內(nèi)毒性試驗(yàn)中進(jìn)行細(xì)胞因子相關(guān)檢測(cè)外，還應(yīng)進(jìn)行體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)。當(dāng)體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果為陰性時(shí)，體外試驗(yàn)陽性結(jié)果可以提示潛在臨床安全風(fēng)險(xiǎn)。

圖7：FDA推薦使用體外試驗(yàn)數(shù)據(jù)用于免疫激動(dòng)劑的首次人體用量外推

體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)由于免疫調(diào)節(jié)劑作用機(jī)理的復(fù)雜性，試驗(yàn)設(shè)計(jì)需要有多樣化的技術(shù)方案，體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)必須要做，如何做才算完整，得到的數(shù)據(jù)如何解讀，并對(duì)免疫調(diào)節(jié)劑的首次臨床劑量選擇起到怎樣的指導(dǎo)作用，這都需要有專業(yè)化的認(rèn)知和實(shí)際經(jīng)驗(yàn)才能進(jìn)行把控。熙寧生物有豐富的免疫調(diào)節(jié)劑IND申報(bào)必檢項(xiàng)-體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，能夠提供性價(jià)比最高的優(yōu)質(zhì)服務(wù)，歡迎咨詢討論。

參考資料：

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6.CDE發(fā)布最新版本的《藥物免疫原性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》

7.熙寧生物非臨床體外試驗(yàn)評(píng)價(jià)服務(wù)介紹.PPT